[10X CellRanger] 커스텀 레퍼런스 만들기
CellRanger에서는 대중적으로 많이 쓰이는 (GRCh38, mm10같은..)reference는 다운받아서 바로 사용할 수 있게 미리 만들어 제공하고 있다.1
다른 종이나 제공하지 않는 버전의 reference를 사용해서 분석하고 싶다면 custom reference를 만들어서 cellranger pipeline에 먹이면 되는데, reference genome sequence(FASTA file)와 gene annotation(GTF file) 정보가 필요하다.2
나는 TdTomato transgene positive한 cell만을 따로 보고 싶어서 제작함. 보통 이런경우에는 FACS로 sorting하고 sequencing하는 것 같긴 하지만 이미 만들었으니 어쨌든.. 만들어보자!
Add a Marker Gene to the FASTA and GTF
나같은 경우에는 원래의 reference + α 가 필요한 케이스.3
10X tutorial에는 GFP를 예시로 나와있는데, TdTomato gene을 추가해보자.
사용한 cellrnager version: cellranger-5.0.1
위에서 언급했듯이 custom reference 만들기 위해서는 fasta file과 GTF file이 필요하다. 나는 cellranger에서 기본제공하는 mm10 reference에 TdTomato 정보를 추가해 완성할 생각이다.
1. Download TdTomato sequence
fasta file에 추가하기 위해 TdTomato sequence를 다운 받아4 tdTomato.fa 로 저장했다.
TdTomato sequence: tdTomato.fa file
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> tdTomato
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGTCATCAAAGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCGCATGGAG GGCTCCATGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAG GGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGAC ATCCTGTCCCCCCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCGTACGTGAAGCACCCCGCCGACATC CCCGATTACAAGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTC GAGGACGGCGGTCTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCACGCTGATC TACAAGGTGAAGATGCGCGGCACCAACTTCCCCCCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAG ACCATGGGCTGGGAGGCCTCCACCGAGCGCCTGTACCCCCGCGACGGCGTGCTGAAGGGC GAGATCCACCAGGCCCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACCTGGTGGAGTTCAAGACC ATCTACATGGCCAAGAAGCCCGTGCAACTGCCCGGCTACTACTACGTGGACACCAAGCTG GACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAGCGCTCCGAGGGC CGCCACCACCTGTTCCTGGGGCATGGCACCGGCAGCACCGGCAGCGGCAGCTCCGGCACC GCCTCCTCCGAGGACAACAACATGGCCGTCATCAAAGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCGC ATGGAGGGCTCCATGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCC TACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCCTTCGCC TGGGACATCCTGTCCCCCCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCGTACGTGAAGCACCCCGCC GACATCCCCGATTACAAGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATG AACTTCGAGGACGGCGGTCTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCACG CTGATCTACAAGGTGAAGATGCGCGGCACCAACTTCCCCCCCGACGGCCCCGTAATGCAG AAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCACCGAGCGCCTGTACCCCCGCGACGGCGTGCTG AAGGGCGAGATCCACCAGGCCCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACCTGGTGGAGTTC AAGACCATCTACATGGCCAAGAAGCCCGTGCAACTGCCCGGCTACTACTACGTGGACACC AAGCTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAGCGCTCC GAGGGCCGCCACCACCTGTTCCTGTACGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
2. Make TdTomato .fa & .gtf
tdTomato가 몇개의 base로 이루어졌는지 알아보자 = 1,431 bases
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cat tdTomato.fa | grep -v "^>" | tr -d "\n" | wc -c
이제 이 정보를 활용해서 tdTomato.gtf file을 만들어보자. GTF file에는 총 9가지 column이 필요하다. \t 로 구분하자.
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echo -e 'tdTomato\tunknown\texon\t1\t1431\t.\t+\t.\tgene_id "tdTomato"; transcript_id "tdTomato"; gene_name "tdTomato"; gene_biotype "protein_coding";' > tdTomato.gtf
tdTomato.gtf file
만들면 이렇게 된다.
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tdTomato unknown exon 1 1431 . + . gene_id "tdTomato"; transcript_id "tdTomato"; gene_name "tdTomato"; gene_biotype "protein_coding";
3. Add TdTomato .fa & .gtf to the end of the mm10 reference file
추가 하기전에 원래 있던 데이터가 손상되지 않게 복사본을 만들어주자.
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cp cellranger-5.0.1/refdata-gex-mm10-2020-A/fasta/genome.fa mm10-2020-A-w-tdTomato_genome.fa
cp cellranger-5.0.1/refdata-gex-mm10-2020-A/genes/genes.gtf mm10-2020-A-w-tdTomato_genes.gtf
아까 만들어둔 tdTomato fasta file과 gtf file을 아래 붙여준다.
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cat tdTomato.fa >> mm10-2020-A-w-tdTomato_genome.fa
grep ">" mm10-2020-A-w-tdTomato_genome.fa // 잘 붙었는지 확인해보자
cat tdTomato.gtf >> mm10-2020-A-w-tdTomato_genes.gtf
tail mm10-2020-A-w-tdTomato_genes.gtf // 잘 붙었는지 확인해보자
4. Make custom reference
지금까지 만든 .fa와 .gtf file을 사용해서 Cellranger count 단계에서 쓸 custom reference를 완성해보자! cellranger mkref를 사용한다.
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cellranger mkref --genome=mm10-2020-A-w-tdTomato \
--fasta=mm10-2020-A-w-tdTomato_genome.fa \
--genes=mm10-2020-A-w-tdTomato_genes.gtf
완성되면 cellranger count 에서 --transcriptome= 옵션에 reference 만들어둔 dir 넣어주면 끝!